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저희가 물성평가를 수행하기 위하여 사용하는 SiriusT3 시스템은 pH 전극 및 UV Spectrometer를 이용하여 pH 2 ~ 12 측정범위내에서 산-염기 용액(0.5M HCl & KOH)을 이용하여 자동으로 적정하는 장치이며, 수 mg의 소량 화합물을 pH 0.2 단위로 적정함으로써 해리상수 (pKa), 분배계수/분배비 (LogP/D) 그리고 pH에 따른 용해도 (Kinetic & Intrinsic)를 각각 측정할 수 있습니다. 

이에 측정된 분배계수와 용해도 수치를 이용하여 BCS Class를 규명할 수 있습니다.

저희 의약품 물성분석은 일반적으로 수용액 상태 (Aqueous solution)에서의 적정을 기본으로 수행하지만 난용성 화합물 (Poorly soluble compounds)에 대한 물성평가를 위하여 메탄올, DMSO 등 다양한 종류의 유기용매 (Co-solvents)를 화합물 특성에 맞게 적용하여 Yasuda-Shedlovsky 분석법으로 해당 물질의 해리상수 값을 용이하게 측정할 수가 있습니다.

따라서 저희가 제공해드리는 각 물성 평가항목들의 분석 과정 및 결과에 대해서 아래와 같이 별도의 항목별로 설명 드리겠습니다.

 해당 평가항목의 기본적인 정의 및 개념에 대한 설명은 추가 자료를 참고 부탁드립니다.

해리상수 (pKa)

일반적으로 약 0.5~1.0mg의 샘플량으로 산(0.5M HCl)과 염기(0.5M KOH) 용액을 사용하여 pH 2~12 범위에서 pH 0.2 단위로 적정하여 형성된 전위차 그래프에서 변곡점 특성을 파악함으로써 정확한 해리상수 값을 얻을 수 있습니다. 

분석 화합물의 주요 작용기에 포함된 이온화 그룹의 수에 따라서 해리상수 결과가 결정됩니다. 

그러나 저희를 포함하여 물성평가 서비스를 제공하는 출연연구소 같은 분석자의 입장에서는 이러한 화학구조식에 대한 정보없이 대부분 Unknown sample로 측정하여 나타나는 전위차 그래프에서 정확하게 판단해야 하므로 SiriusT3 시스템에 대한 전문성이 결여된 분석자의 경우 정확한 데이터 해석능력이 다소 떨어져 정확하지 않는 해리상수 값을 보고할 수가 있습니다.

아래 그래프는 100% 수용액에서 pH-metric pKa Assay를 이용한 Chlorpheniramine의 실제 pKa 측정값 (pKa₁ 3.72, pKa₂ 9.25; base group for both) 을 나타내고 있으며 화합구조식에서 보여진 pKa 예측값 (4.46 & 9.33) 들과 유의미한 차이를 볼 수 있습니다.

 ACD/Lab, Chemdraw 등과 같은 예측프로그램으로 확인할 수 있는 예측 값들과 실제 측정값들에서 유의미한 차이를 보이는 것이 일반적이므로 반드시 실측값으로 판단해야 합니다.

물에 잘 녹지 않은 화합물의 해리상수를 분석하기 위하여 메탄올, DMSO 등과 같은 유기용매를 사용해야만 적정과정에서 침전을 형성하지 않고 정확하게 해리상수를 측정할 수 있습니다. 

하지만 메탄올 또는 DMSO와 같은 일반적인 용매를 사용하더라도 특정 pH (주로 그 화합물의 pKa가 존재하는 pH) 범위에서 석출되어 해리상수 측정이 불가한 경우가 발생합니다. 

또는 특정 화합물이 메탄올에 잘 녹아 쉽게 측정되더라도 그 화합물의 작용기와 메탄올과의 예측하지 못한 반응에 따른 pH전극의 전위차 왜곡으로 부정확한 pH leading 데이터가 검출되어 잘못된 해리상수 값이 정확한 측정치인 것으로 오인할 수 있는 경우도 드물게 발생합니다(이러한 케이스는 별도로 정리하여 자료실에 업로드 하겠습니다).

 이 경우 분석자가 해당 샘플의 화학구조식 정보를 가지고 있으면 판단이 가능하지만 대부분 그렇지 않기 때문에 잘못된 결과값이 결정되어 보고됩니다. 따라서 난용성물질의 경우 용해시키기 위한 유기용매를 선택할 때 주의 깊은 신중이 필요합니다.

위의 그래프와 같이 유기용매를 사용하여 나타난 전위차 그래프에서도 동일하게 pKa 값을 결정할 수가 있습니다. 

그러나 단 1%의 유기용매라도 샘플을 녹이기 위하여 사용되었다면 그 값은 pKa가 아니라 psKa 값으로 명명해야 합니다 (pKa ≠ psKa). psKa에서 s는 solvent를 의미하며 pKa는 100% 수용액에서의 해리상수 값으로 정의합니다. 

최근에는 지방에서 물성평가를 지원하는 출연연구소에서 이 psKa 값을 해당 샘플의 pKa 값으로 고객에게 보고하는 어처구니 없는 경우가 있었습니다. 

유기용매를 사용하는 분석법을 모르는 고객들은 당연히 그 psKa 수치를 pKa 값으로 받아들여 CTD에 작성하여 제출하였을 것입니다. 

따라서 유기용매를 이용하여 해리상수를 측정하였더라면 그 해당 화합물의 정확한 pKa 값을 결정하는데 반드시 Yasuda-Shedlovsky Extrapolation 법을 사용해야 합니다.  

위 그림은 Famotidine의 화학구조식을 ACD/Lab으로 예측한 결과입니다. 

이 물질은 총 6개의 이온화그룹들이 존재하며 그 중 pH 2~12의 범위에서 해리상수 값을 나타낼 만한 그룹들은 모두 3개로 판단됩니다.

 어디까지나 예측입니다. 실제 Famotidine은 난용성 물질이므로 수용액에서는 침전으로 인하여 적정이 불가합니다. 

따라서 각각 50%, 40% 그리고 30%의 DMSO를 이용하여 총 3회 측정하였으며 그 결과 나타난 전위차 그래프는 아래와 같습니다.

 전위차 그래프에서 침전이 발생하지 않았으며 총 2개의 변곡점이 확인되었습니다. 

각각의 변곡점이 존재하는 pH영역에서의 psKa 값들을 Yasuda-Shedlovsky Graph로 나타낼 수 있습니다. 

DMSO의 사용 %를 달리하여 총 3회 반복측정으로 각각의 적정으로 나타난 psKa 수치들을 Regression Curve에서 0%의 psKa값을 산출할 수가 있으며, 

이 물질의 pKa 값과 동일하다는 개념이 Yasuda-Shedlovsky Extrapolation법 입니다.

 Regression Curve가 2개로 측정되었으며 빨간색 커브는 Acidic pKa 9.69그리고 파란색 커브는 Basic pKa 6.58를 의미합니다.  

결론적으로 예측프로그램의 결과와 측정치가 비교 가능하며 다소 큰 유의미한 차이를 발견할 수가 있습니다. 

만약 예측값과 실측값의 차이가 < ±0.3의 수준이라면 거의 동일한 결과로 판단해도 되겠습니다. 

마지막으로 측정되는 pKa의 종류, 즉 Acidic 또는 Basic 인지를 파악하는 것 또한 측정하는 것 만큼 중요합니다. 

Famotidine의 화학구조식에서 예측 해리상수 값과 실측 값을 이온화 그룹별로 직접적으로 비교 판단이 가능합니다. 

하지만 무엇보다도 이후에 진행되는 LogP/D와 pH에 따른 용해도 분석에서 아주 중요한 변수로 반드시 작용하기 때문에 pKa의 종류를 파악하는 것이 아주 중요합니다.

(잘못된 pKa 종류로 인한 LogP/D와 용해도 수치의 변화를 별도의 케이스로 자료를 구성하여 업로드 하겠습니다).