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정확한 개념을 알려드리고자 친지질도 평가에 대하여 간략하게 언급하자면, 친지질도 평가의 목적은 경구약물이 인체에 복용되어 약물이 목표로 하는 여러 인체 장기들 중 일부에서 우선 이온화 과정(해리상수 관련)을 거쳐 용해되어야 하며(pH에 따른 용해도 관련), 그 후 용해된 약물의 농도가 지질성을 표현하는 인체 장기의 내벽 또는 멤브레인에 접근하는 정도를 수치로 나타내기 위함입니다. 쉽게 설명하자면 “약물이 특정 인체 장기에서 용해되어 내벽 또는 멤브레인을 얼마나 좋아하여 이동하는 것”인지 그 특성을 파악하는 물성 평가항목이 분배계수/분배비(LogP/D) 입니다.

예를 들어 위 또는 십이지장에서 약물이 녹으면 수용액 상에서 농도를 구성하게 되고, 이 농도가 해당 장기의 내벽 또는 멤브레인(지질성)에 친근한 성향을 나타내는 정도를 옥탄올(지질성) 상의 농도로 표현할 수 있습니다. 즉 친수성 약물인 경우 수용액 층의 농도가 옥탄올 층의 농도보다 큰 성향을 가지고 있어야 하며, 반대로 친지질성 약물이라면 옥탄올에 녹은 농도가 수용액 층의 농도보다 더 큰 성향을 가지는 것입니다. 따라서 해당 약물의 수용액 층의 농도와 옥탄올 층의 농도의 비율이 분배계수(LogP) 값으로 정의되며, 이 분배계수는 pH가 변하더라도 바뀌지 않는 상수 값의 특성을 가지고 있습니다. 하지만 인체 장기가 부위별로 서로 다른 pH를 가지고 있기 때문에 pH에 따른 친수성/친지질성을 파악해야 하는데 이를 pH에 따라서 변화하는 값인 분배비(LogD) 값이라고 합니다.

의약품의 분배계수 또는 분배비를 측정하는 친지질도 평가는 약물이 침투/투과하여 Blood System으로 이동하는 과정과는 별도로 판단되어야 하며, 이는 PAMPA 또는 Caco-2 cells의 분석법을 이용한 약물의 Permeability에 해당되는 개념입니다.

분배계수/분배비 (LogP/D, 친지질도)

해리상수 측정과 동일하게 일반적으로 약 0.5~1.0 mg의 샘플량으로 pH 2 ~ 12 범위에서 산과 염기 용액으로 적정함으로써 pH전극을 이용한 전위차를 검출하여 측정하지만 수용액과 더불어 지질성을 나타내는 옥탄올을 추가로 주입하여 측정하는 방식입니다. 좀더 신뢰도 높은 결과를 얻기 위하여 일반적으로 수용액과 옥탄올의 비율을 다양하게 3회 이상의 반복측정으로 진행하며 최종 분석결과는 화합물의 수용액에서 농도와 옥탄올에서 농도의 비율인 LogP 또는 LogD로 설명할 수 있습니다. 화합물 고유의 물성에 따라서 다양한 결과값을 나타내는데, 물성 예측 프로그램들에서 얻을 수 있는 LogP/D예측값들과 실제 측정값들 사이에 현저한 차이를 보이고 있는 것이 일반적입니다.

따라서 SiriusT3 시스템은 물과 옥탄올의 다양한 볼륨을 적용함으로써 신뢰도 높은 테스트를 지원하며, 해리상수 분석과 마찬가지로 소량의 샘플로 pH 전극을 이용하여 측정할 수가 있습니다. 그 결과 LogP 측정 값 뿐만 아니라 아래와 같은 pH vs. LogD Profile (pH vs. LogD Table)을 제공함으로써 pH에 따른 약물의 친지질성(LogD)을 한눈에 파악할 수가 있습니다.

다음의 데이터 프로세싱은 해리상수 값을 계산하는 것과 동일한 과정으로 분배계수/분배비 측정된 전위차 그래프에서 정확한 프로세싱이 되어야 합니다. Chlorpheniramine의 해리상수 분석결과 두 개의 실측 pKa 값 (pKa₁ 3.72, pKa₂ 9.25)을 나타내었으며, 이들 모두 Basic group에서 이온화된 해리상수 값입니다.

위 전위차 그래프는 물과 옥탄올 비율을 다르게 구성하여 3회 반복 적정한 결과입니다(파란색, 빨간색 그리고 초록색으로 구성하고 있는 적정포인트와 해당 실선). 일반적으로 위 그래프에서 정확한 LogP와 LogD 값을 계산하기 전 반드시 해리상수 값을 T3 Software에서 디폴트 변수 값으로 지정해야만 합니다(해리상수 값으로 표현한 것이 검은색 실선입니다). 따라서 검은 실선(pKa values)과 친지질도 적정하여 나타난 3가지의 선들을 기준으로 데이터 프로세싱하면 위의 그래프와 같이 파란색 점(또는 빨간색/초록색 점)들이 파란색 선(또는 빨간색/초록색 선)과 적합하게 Fitting이 일치하는 결과를 나타냅니다. 각 색별로 점과 실선의 Fitting 되는 정도에 따라서 분배계수/분배비 결과의 신뢰도를 결정합니다(이는 RMSD수치로 확인 가능합니다).

여기서 아주 중요한 것은 화살표로 나타낸 것처럼 두 번째 이온화 과정으로 나타난 pKa₂영역에서 검은 실선보다 왼쪽으로 이동(shift) 되었다는 사실입니다. 이는 해리상수의 종류에 따른 전형적인 특성인데, Basic pKa의 경우 왼쪽으로 Acidic pKa의 경우 오른쪽으로 이동되어야 합니다. 파란색, 빨간색 그리고 초록색 선들이 간격을 두고 다르게 적정 된 이유는 본 실험에 사용된 옥탄올의 양이 다르기 때문입니다.

위 그래프에서 pKa₁영역에서는 이론상 Basic pKa₁이기 때문에 왼쪽으로 이동되어 나타나야 하는데 그렇지 않은 이유는 본 화합물인 Chlorpheniramine의 특성으로 볼 수 있습니다. 결론적으로 LogP (또는 LogD)의 수치는 검은 실선을 기준으로 해당 해리상수 값에 비하여 왼쪽(또는 오른쪽)으로 이동되는 정도에 따라서 결정됩니다. 더 크게 이동될수록 LogP 값은 클 것이며, 반대로 친수성이 강한 물질들은 검은 실선과 거의 변별력이 없이 나타나기도 합니다. 

위 전위차 그래프에서 정확하게 데이터 프로세싱 과정을 수행했다면 아래와 같은 pH vs. LogD Profile 그래프가 형성되어 LogP가 존재하는 pH 범위 뿐만 아니라 pH에 따라서 변화하는 LogD 값의 추이를 확인할 수 있습니다. Chlorpheniramine은 LogP 값이 3.25로 측정되었으며 10.0 < pH < 12.0 범위에서 존재하는 수치입니다. 그리고 pH 10.0 이하의 범위에서는 LogD 값으로 표현되며 pH가 감소할수록 LogD 값도 감소하는 추이를 나타내었습니다. 혈중 pH를 나타내는 pH 7.4에서 LogD 값은 1.25로 나타내어 LogP >> LogD @ pH 7.4으로 설명할 수가 있습니다. 결론적으로 Chlorpheniramine의 LogP 수치가 3.25이라는 의미는 수용액 상의 농도보다 옥탄올에 녹은 농도가 10^3.25만큼 크다는 것을 의미하며 따라서 아주 친지질성 물질로 판단할 수 있습니다.

다음은 Acidic pKa와 Basic pKa 모두 가지고 있는 Famotidine의 LogP/D 분석결과에 대한 설명입니다. 앞서 설명한 것처럼 Basic pKa 영역에서 옥탄올 때문에 왼쪽으로 이동된 적정선이 나타나며 Acidic pKa 영역에서는 오른쪽으로 이동 적정 된 결과가 나타나야만 합니다. 두 개의 해리상수 중 Basic pKa₁이 존재하는 구역에서 이동은 거의 나타나지 않았는데 이는 앞의 Chlorpheniramine의 첫번째 pKa가 존재하는 범위의 특성과 유사한 것으로 파악되었습니다. 하지만 Acidic pKa₂가 존재하는 범위에서 검은 실선과 비교하면 오른쪽 이동되어 측정이 완료된 것을 알 수가 있습니다. 이는 해리상수 측정에서 나타난 두번째의 pKa 종류가 Acidic pKa 인지를 분명히 확인할 수 있는 부분이며, 물/옥탄올 비율을 달리하여 총 4회에 걸친 반복 측정 후 LogP/D 데이터 프로세싱의 완벽한 과정을 의미합니다. 그 결과 신뢰도 높은 LogP 와 LogD 수치를 도출하였습니다.

Famotidine의 친지질도 결과를 설명하자면, LogP = 1.95으로 측정되었고 2.0 < pH < 5.0 의 친지질성을 나타내는 범위를 구성하였습니다. pH 5.0 이상의 구간에서는 LogD 값으로 표현되며 pH가 증가할수록 친수성 경향을 가지는 것으로 나타났습니다. 혈중 pH를 나타내는 pH 7.4에서 LogD 값은 1.65로 나타내어 LogP > LogD @ pH 7.4으로 설명할 수가 있습니다. pH에 따른 LogD 수치들은 저희 최종결과보고서에 포함되는 pH vs. LogD Profile 또는 pH vs. LogD Table 섹션에서 확인할 수 있습니다.

의약품 물성평가 중 해리상수(pKa) 측정과 분배계수/분배비(LogP/D) 분석과정은 아주 유사하게 진행되어야 합니다. 우선 해당 샘플의 용해도 특성을 감안하여 최소한의 샘플량으로 적정해야 하며 샘플의 용해성이 너무 낮은 경우 적정 중 침전 또는 석출이 되는 경우가 빈번하게 발생합니다. 이러한 경우 침전 또는 석출로 인하여 수용액과 옥탄올 층에 녹아 있는 샘플의 과포화 작용으로 인하여 왜곡된 전위차 데이터가 검출됨으로써 일반적으로 정확한 측정값을 도출하기가 어렵습니다. 해리상수 분석에서는 다양한 유기용매를 사용하여 침전으로 인한 과포화를 방지하여 정확한 측정값을 결정할 수가 있지만 친지질도 분석에서는 그렇지 못하기 때문에 신중한 분석기법이 필요합니다.

마지막으로 해당 물질의 pKa의 종류, 즉 Acidic 또는 Basic pKa 규명이 해리상수 분석으로 분명히 이루어져야 합니다. 산-염기 적정법으로 나타난 전위차 그래프에서 샘플의 주요 작용기에서 이온화된 해리상수와 물/옥탄올 사이의 전형적인 특성을 잘 파악해야지만 정확하고 신뢰도 높은 결과값을 얻을 수 있습니다(pKa 종류를 잘못 파악함으로써 나타나는 LogP/D 값의 차이에 관한 Case Study 설명자료를 별도로 구성하겠습니다).

현재까지도 물성평가 서비스를 제공하는 정부 출연연구소에서 발행한 결과보고서를 확인한 결과, 출연연구소 분석자가 이러한 내용의 부재로 인하여 전혀 엉뚱한 LogP와 LogD 값을 고객들에게 전달하고 있었습니다. 저희는 이러한 잘못된 결과에 대해서 아무런 분별력 없이 그대로 의약품 개발과정의 데이터로 이용하거나 CTD자료에 기입하여 제출함으로써 발생할 수 있는 오류와 관련하여 도움을 드리고자 합니다.