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SiriusT3를 이용한 물성 평가항목들 중 용해도분석이 가장 난이도가 높으며 상대적으로 용해도에 대한 높은 이해도가 요구되는 항목입니다. 반면 오랜기간동안 사용되어온 전통적인 Shake-Flask Method는 HPLC 시스템과 연계하여 용해도에 관한 높은 이해도 없이 널리 사용되고 있는 용해도 분석법입니다. 용해도를 측정하는데 기타 다른 분석법이 존재하지만 이 두 가지의 방법이 가장 많이 사용되고 있으므로 이 분석법들의 장단점에 대하여 간략하게 다음과 같이 설명 드립니다.

Shake-Flask Method는 샘플 전처리의 형태로 진행되며 단순한 용해도 개념만으로 분석이 가능합니다. 그러나 뒤이은 HPLC 정량분석 과정을 반드시 거쳐야 정확한 pH에 따른 용해도 값을 측정할 수가 있으므로 해당 화합물에 대한 HPLC Method Development 과정에 상당한 시간과 노력이 수반되어야 하는 단점이 있습니다. 뿐만 아니라 다량의 해당 화합물을 이용한 샘플 전처리 과정으로 다양한 타겟 pH에서 우선적으로 과포화(Saturation) 상태를 만들어야 하는데 이를 육안으로 확인한 후 매뉴얼 샘플링이 진행되어야 하므로 실험자 간의 오차가 다소 큰 단점이 있습니다. 하지만 SiriusT3은 일반적으로 수 mg 샘플만으로 산-염기 적정 과정을 거치면서 UV Spectrometer (Turbidity Sensor)에 의한 과포화상태를 일관성 있게 감지하면서 약 1~2hr 분석기간 중 pH에 따른 용해도 값을 정확하게 측정할 수 있는 큰 장점이 있습니다.

수용액에서 해당 물질의 과포화상태라 함은 정해진 볼륨의 물에 다량의 샘플을 지속적으로 주입하고 녹이는 과정을 반복하면서 더 이상 물에 녹지 않고 침전(또는 석출)현상이 일어날 때의 상태가 샘플이 Saturation 되었다고 하며 과포화상태로 정의합니다. 화합물의 고유 특성인 용해성에 따라서 침전되어 과포화상태가 되기까지 주입되는 샘플량이 달라질 수밖에 없습니다. 쉽게 설명하자면 물에 잘 녹는 물질은 잘 녹지 않는 물질보다 상당히 많은 양의 샘플을 주입해야 침전현상을 만들 수 있으며 이에 따른 용해도의 차이가 발생할 수밖에 없다는 것입니다. 일정량의 샘플이 반복 주입되는 과정 중 수용액 상에서 최초로 침전되어 과포화상태가 이루어졌다면 그 때의 용해도 값을 동적용해도(Kinetic Solubility)로 정의합니다. 이 후 특정 pH에서 침전된 화합물의 성상이 시간이 지나면서 안정화 단계에 이르렀을 때의 용해도 값이 정적용해도(Equilibrium Solubility) 입니다. 하지만 이는 분석하는 입장에서 모호한 개념입니다. 육안으로 과포화상태를 감지할 때까지 사용된 샘플량(또는 높은 농도)에 의하여 수용액의 pH가 변하게 될 것이며 목표로 하는 특정 pH로 보정하는 경우 추가적으로 버퍼 용액이 투입되기 때문에 전체 볼륨의 왜곡으로 인한 다소 부정확한 용해도 값이 나타나게 됩니다. 그리고 일반적으로 24hr의 Shaking후 안정화 기간이 지나더라도 샘플의 결정형(Crystallinity)에 따라서 수용액에서 약물의 거동(Drug Behavior)이 변화하는데 이 부분을 고려할 수 없는 한계가 있습니다.

따라서 SiriusT3를 이용한 용해도 측정법에 대한 이론적인 개념을 이해하기 쉽지는 않지만 세계적으로 출원된 특허(CheqSol, Sirius Analytical Ltd.)를 보유하고 있으므로 그 용해도 측정에 따른 결과는 Shake-Flask Method 와 비교하여 볼 때 보다 신속하고 신뢰도 높은 결과를 제공합니다. 이와 더불어 앞서 측정되어야 하는 pKa와 LogP/D의 분석결과와 함께 용해도 결과(LogS)를 바탕으로 해당 화합물의 BCS Class 등급의 판단이 유의미하게 진행될 수가 있습니다. 아래의 내용은 SiriusT3를 이용한 용해도 분석방법과 결과에 관한 것입니다. 분석자의 입장에서 반드시 알아야 하는 이론적인 개념에 대해서 간략하게 알려드립니다. 하지만 물성평가를 의뢰하는 입장에서 이해하는데 다소 쉽지 않은 부분이 있으므로 결과에 대한 참고자료만으로 고려하시면 좋을 듯 합니다. 이러한 이유로 물성평가서비스를 제공하는 정부 출연연구소에서는 저렴한 SiriusT3를 이용한 용해도 분석을 지원하지 않고 있으며 고비용의 Shake-Flask Method만 제공하고 있는 실정입니다.

pH에 따른 용해도

과포화상태의 수용액을 형성해야 하기 때문에 pKa와 LogP/D 측정과는 달리 일반적으로 다소 많은 양 (약 5~10mg)의 화합물이 용해도 측정에 필요하며 측정 과정은 pKa측정과 동일하게 진행됩니다. 약 10mg 샘플을 샘플바이얼에 칭량한 후 SiriusT3 소프트웨어를 통하여 적정을 시작하면 pH 2~12 범위에서 자동으로 산-염기 적정이 진행되고 완료됩니다. 따라서 샘플의 전처리가 필요하지 않고 고상 및 액상 샘플 그대로 적용이 가능합니다.

해당 화합물의 특성, 즉 Acidic/Basic compounds 또는 Ampholyte/Zwitterion compounds 인지에 따라서 SiriusT3를 이용한 용해도 분석법은 CheqSol법과 Curve-fitting법으로 나누어 집니다. 따라서 해리상수 분석결과로 해당 화합물의 정확한 pKa수치와 종류를 측정해야 하는 이유이며, 이러한 정확성에 따라서 LogP/D뿐만 아니라 용해도의 결과에 아주 큰 변수로 작용하기 때문에 SiriusT3를 이용하여 물성평가하는 분석자가 반드시 알아야하는 아주 중요한 부분입니다.

전통적인 용해도 측정법인 Shake-Flask Method 처럼 다량의 샘플 주입과 침전 상태에서 24시간 동안 Shaking하고 추가 24시간 동안 Stabilizing 할 시간적 여유가 SiriusT3에는 필요 없습니다. 그 대신 SiriusT3가 과포화상태를 형성한 후 임의적으로 pH를 조정해 가면서 과포화 된 수용액을 Equilibrium 한 상태로 유지할 수가 있습니다. CheqSol은 이러한 장점을 바탕으로 고안된 분석법입니다. 즉 임의로 형성된 Equilibrium한 상태로 장시간 동안 유지하면 평균 농도값이 형성되는 구간이 존재하고 그것이 Equilibrium Solubility 구간으로 간주할 수 있다는 개념입니다. 이 Equilibrium Solubility 구간을 설명하기 위하여 과포화(Saturation)조건을 더 정밀하게 Supersaturation 상태와 Subsaturation 상태로 나뉘어야 합니다. 즉 충분한 샘플이 물에 녹은 후 과포화상태가 되면 샘플바이얼에는 두 개의 층이 생기는데 수용액 층의 농도 C_liquid 보다 침전 층의 농도 C_solid가 훨씬 높은 조건이 형성됩니다(C_liquid << C_solid). 이 때의 조건을 Supersaturation 상태라고 하며 f(pH, time, temp)이 변수로 작용될 수 있습니다. 이 변수들 중 pH와 time을 조정하면서 산-염기 적정을 계속 진행하면 수용액 층의 농도 C_liquid 보다 침전 층의 농도 C_solid가 훨씬 낮은 조건이 형성됩니다(C_liquid >> C_solid). 이 때의 조건을 Subsaturation 상태라고 합니다. 아래의 그림에서 볼 수 있듯이 최초로 침전이 형성되어 과포화상태에서의 농도가 Kinetic Solubility 값으로 측정되었으며 그 후 시간이 경과함에 따라서 pH전극으로 전위차의 변화를 측정함으로써 Supersaturation와 Subsaturation 상태를 반복적으로 구성할 수 있는 구간이 형성되는데 이 구간을 Equilibrium Solubility 구간(또는 Chasing 구간)으로 해당 물질의 정적용해도를 측정할 수 있습니다. 즉 물질의 평형상태(equilibrium)를 쫓아가면서(chasing) 용해도를 측정하는 방법입니다.

아래의 그래프는 Crystal Form형태를 가진 화합물 Warfarin을 이용하여 CheqSol법으로 pH별 용해도를 측정한 결과를 나타내고 있습니다. 샘플 약 5mg을 이용하여 산-염기 적정 시작한 후 약 25분이 경과하였을 때 침전이 처음 형성되면서 과포화상태가 되었습니다. 이때의 Kinetic Solubility 농도값이 계산되었으며 그 후 시간이 경과하면서 Chasing 구간을 약 1.5시간동안 형성하였습니다. 이 구간에서의 평균 농도가 Warfarin의 Equilibrium Solubility 값으로 측정되었으며 전체적으로 시간에 따른 용해도의 변화를 확인할 수가 있습니다. 마지막으로 Warfarin의 pH에 따른 용해도를 Solubility vs. pH Profile (Solubility vs. pH Table)에서 파악할 수가 있습니다. 이에 따르면 pH < 4.0까지 동일한 LogS값을 유지하였으며 pH > 4.0 의 범위에서는 pH가 상승할수록 LogS 값도 비례하여 상승한다는 것을 알 수 있습니다.

다음은 해리상수 및 분배계수/분배비 물성평가항목 설명에서 사용되었던 Famotidine을 CheqSol법으로 용해도 측정한 결과를 나타내고 있습니다. 이 물질은 Basic pKa₁ 6.71 및 Acidic pKa₂ 9.69를 가진 Ampholyte Compound 입니다. Famotidine은 비교적 난용성 물질이기 때문에 약 3mg의 샘플량으로 Low pH에서 High pH로 산-염기 적정과정을 거쳤으며 pH 8.0에 이르렀을 때 침전이 형성되면서 과포화상태가 처음 발생하였습니다(첫 번째 전위차 그래프). 이 시점에서 측정된 Kinetic Solubility 9.13 mM으로 나타났습니다. 이 후 Equilibrium Solubility 구간, 즉 Chasing 구간을 형성하기 위하여 산-염기 적정이 계속 진행되었으며 그 결과 pH 7.3 영역에서 Supersaturation과 Subsaturation 조건을 형성하면서 완벽한 Chasing 구간이 형성되었습니다. 이 Chasing 구간에서 측정된 Famotidine의 Equilibrium Solubility 2.689 mM (LogS = -2.57)로 측정되었습니다. 마지막으로 pH에 따른 용해도를 파악하기 위하여 Solubility vs. pH Profile에서 나타난 전체적인 용해도 변화추이를 확인할 수 있고, Solubility vs. pH Table에서 각 pH별 측정된 용해도 값을 확인할 수 있습니다. Solubility vs. pH Profile 그래프를 보면 pH 8.0 영역에서 Famotidine의 정적용해도 값이 측정되었으며 pH 8.0 이하 및 이상의 범위에서는 용해도 값이 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이러한 pH 별 용해도 수치의 변화는 Solubility vs. pH Table 에서 정확하게 확인할 수 있습니다.

위 Warfarin 및 Famotidine 처럼 SiriusT3를 이용하여 CheqSol 법으로 용해도를 측정할 수 있는 화합물을 Chaser Compound라고 합니다. 모든 의약품의 성분들이 CheqSol 법으로 측정 가능한 것은 아니며 CheqSol 법으로 용해도 측정이 불가능한 물질들을 Non-chaser Compound라고 합니다. 이러한 물질들은 임의로 Supersaturation과 Subsaturation 조건을 형성하지 못하여 Chasing 구간이 존재하지 않고 Supersaturation 상태만 형성하는 특징을 가지며, 또 다른 측정법인 Curve-fitting method를 사용해야만 합니다. 이에 대해서는 별도의 자료를 구성하여 설명 드리겠습니다.

마지막으로 앞서 예시된 두 물질들은 시판중인 표준품으로 잘 정제된 Crystal Form의 결정형태를 가지고 있으며 측정결과 또한 깔끔하게 잘 나타났습니다. 그러나 개발중인 합성 물질들의 대부분은 이러한 형태를 가지는 경우는 드물며 대부분의 경우 Polymorph 또는 Amorphous form의 형태인 샘플들입니다. 물론 이러한 샘플도 SiriusT3를 이용하여 용해도를 충분히 측정할 수가 있습니다. 이 샘플들의 용해도 분석결과는 앞에서 본 그래프와는 다소 다르게 나타나며 이에 따른 설명이 필요하므로 추가자료를 구성하여 자료실에 업로드 하겠습니다.